L’ingegneria dei tessuti

Tissue engineering è la scienza che studia la realizzazione di tessuti semiartificiali con proprietà meccaniche e fisiologiche del tutto uguali a quelle "originali". Si distingue dall'ingegneria genetica perchè le cellule, pur riprodotte in grande quantità in laboratorio, provengono dallo stesso paziente sul quale verranno innestate ed avendo inoltre, un patrimonio genetico intatto ed invariato, sono prive del rischio di rigetto e di contaminazione virale. La guarigione delle ferite è un fenomeno complesso, ma ordinato che coinvolge diversi processi.

Un’esempio di riparazione delle ferite è fornito dalla guarigione per prima intenzione di una incisione chirurgica, con morte di un numero limitato di cellule epiteliali e connettivali e l'interruzione della continuità della membrana basale. Nei primi minuti vi è la formazione di un coagulo, contenente fibrina e cellule ematiche; la disidratazione della parte superficiale forma la ben nota crosta, che ricopre la ferita. Entro le 24 ore, fase dell'infiammazione, i neutrofili compaiono ai margini dell'incisione, muovendosi verso il coagulo di fibrina, e l'epidermide si ispessisce grazie all'attività mitotica delle cellule basali.

Entro le 24-48 ore, fase della proliferazione, gemme di cellule epiteliali crescono dai bordi, migrano lungo i margini del derma, depositando nel loro movimento componenti della membrana basale. Infine si fondono al centro della ferita, sotto la superficie della crosta, producendo uno strato epiteliale continuo ma sottile. Entro il terzo giorno i neutrofili sono stati in larga misura sostituiti dai macrofagi, importanti costituenti del tessuto di granulazione, che invade progressivamente lo spazio, e responsabili dell'eliminazione dei detriti extracellulari, della fibrina e di altro materiale estraneo nella sede di riparazione.

Queste cellule inoltre, elaborano TGF-B, PDGF e b-FGF, promuovendo quindi la migrazione e la proliferazione dei fibroblasti. Fibre di collagene appaiono ai margini, ma disposte verticalmente e quindi non ancora idonee a saldare i lembi della ferita. Continua la proliferazione delle cellule epiteliali che aumentano lo spessore dello strato epidermico. Entro il quinto giorno lo spazio dell'incisione è riempito da tessuto di granulazione. Le fibre collagene divengono più abbondanti, saldando solo ora i lembi della ferita. La sintesi di collagene è stimolata da fattori di crescita (TGF-B, PDGF, FGF) e citochine (IL-1, IL-4) che vengono secrete dai leucociti e dai fibroblasti, nelle ferite in via di guarigione. L'aumento netto della quantità di collagene è controllato anche a livello della sua degradazione. L'epidermide ritrova il suo normale spessore e il differenziamento cellulare porta alla cheratinizzazione della superficie. Durante la seconda settimana si ha continuo accumulo di collagene e proliferazione di fibroblasti. L'infiltrato leucocitario, l'edema e l'eccesso di vascolarizzazione sono in larga misura scomparsi. Inizia il lungo processo di schiarimento, dovuto all'aumento del collagene all'interno della cicatrice e accompagnato dalla regressione dei canali vascolari. La migrazione dei fibroblasti nella sede del danno, e la loro susseguente proliferazione, sono innescate da diversi fattori di crescita, tra cui TGF-B, PDGF, EGF, FGF dalle citochine fibrogeniche, interleuchina (IL-1) e TNF-B. Tra le fonti di questi fattori di crescita ci sono le piastrine e diverse cellele infiammatorie, oltre all'endotelio attivato e macrofagi. Se sono presenti stimoli chemiotattici appropiati, anche i mastociti, gli eosinofili e i linfociti possono aumentare di numero. Ognuno di queste cellule può contribuire direttamente o indirettamente alla migrazione e alla proliferazione dei fibroblasti. Il TGF-B, prodotto da cellule del tessuto di granulazione, sembra evere il ruolo più importante per la moltitudine di effetti: induce la migrazione e la proliferazione dei fibroblasti, l'aumento della sintesi di collagene e fibronectina e riduzione della degradazione della matrice extracellulare ad opera di metalloproteasi.

Il TGF-B ha anche un'azione chemiottatica per i monociti e induce angiogenesi, forse richiamando i macrofagi. Alla fine del primo mese la cicatrice è costituita da un tessuto connettivo cellulare, privo di infiltrato infiammatorio, ricoperto da epidermide intatta. Gli annessi dell'epidermide e del derma non rigenerano e può rimanere una cicatrice di tessuto connettivo denso al posto della trama di collagene presente nel derma intatto. Alcuni dei fattori di crescita (PDGF, FGF) che stimolano la sintesi del collagene e di altre molecole del tessuto connettivo, modulano anche la sintesi e l'attivazione delle metalloproteasi (prodotti da macrofagi, neutrofili, fibroblasti ), enzimi che degradano questi componenti della matrice extracellulare. Il bilancio netto di sintesi e degradazione definisce il rimodellamento del tessuto connettivo Se la perdita di sostanza è più cospicua, si ha inevitabilmente una maggiore quantità di fibrina, di detriti necrotici e di essudato, che devono essere rimossi. Di conseguenza la reazione infiammatoria è più intensa. Si formano maggiori quantità di tessuto di granulazione e compare il tipico fenomeno della contrazione della ferita ascritto, almeno in parte, alla presenza di miofibroblasti, fibroblasti modificati aventi le caratteristiche ultra strutturali di cellule muscolari lisce. Le lesioni in cui è più indicato il trattamento con innesti autologhi coltivati sono le lesioni croniche, definite "difficili" con le terapie convenzionali, che appaiono congelate nella fase infiammatoria o proliferativa. Sono ferite profonde, estese, con margini irregolari, non tendenti alla guarigione spontanea; sono gravi perdite di sostanza dermo-epidermica determinate da moltiplici cause. I fattori di crescita, peptidi della classe delle citochine (PDGF), appaiono diminuiti nelle lesioni croniche per ridotta sintesi, aumentata distruzione , deficit recettori e per inattivazione. Dopo un lungo periodo di ricerca, durato circa 15 anni, si è potuto realizzare una matrice biointegrata, a base di polimeri derivati dall'acido jaluronico, sulla quale si seminano i cheratinociti e i fibroblasti prelevati dal paziente. L'acido jaluronico nella cute sana è presente in quantità e facilità l'idratazione, influenza la mobilità e la proliferazione cellulare; mentre nella cute in cui sono in atto processi riparativi aumenta notevolmente la sua concentrazione facilitando la crescita e il differenziamento cellulare. In natura questo zucchero si trova in forma di gel non lavorabile, ma dal 1997, grazie ad una piccola manipolazione strutturale (esterificazione del polisaccaride naturale con alcool benzilico), è stato tradotto nello stato solido ed è quindi in grado di essere elaborato in una grande varietà di forme fisiche, quali garze, fili, matrici tridimensionali di supporto per il derma, a lamine per i cheratinociti. E’ in grado di garantire una corretta organizzazione tridimenzionale con adesione, proliferazione e produzione dei pre-costituenti dermo-epidermici.

I requisiti importanti di questa impalcatura tridimensionale sono la biocompatibilità, ossia la possibilità del tessuto di essere riconosciuto come propio dalle cellule dell'organismo in cui viene innestato, e la biodegradabilità, ossia la capacità della matrice di venire riassorbita dai tessuti con i quali viene in contatto (entro 4 settimane), senza lasciare tracce tossiche e senza determinare rischiose reazioni infiammatorie o sensibilizzanti. Materiali e metodi Il protocollo di trattamento prevede una fase pre-innesto durante la quale si procede alla biopsia cutanea (circa 2x2 cm.) a tutto spessore, prelevata da un’area non lesionata ed inviata, contenuta in un kit apposito, ai laboratori. I fibroblasti ottenuti dalla biopsia cutanea, proliferano nel corso della fase della coltura primaria, della durata di 8 giorni, vengono quindi seminati su una trama tridimensionale dove, in 7 giorni, proliferano e iniziano a produrre i costituenti della matrice extracellulare del derma.

I fibroblasti autologhi vengono coltivati in presenza di proteine non omologhe: è siero fetale bovino proveniente da allevamenti controllati e certificati. In seguito all'applicazione, sul letto della ferita, continuano a proliferare fino a formare un letto dermale granuleggiante e ben vascolarizzato, quindi idoneo, all'innesto di lamine di cheratinociti autologhi. I cheratinociti proliferano anch'essi nel corso della fase della coltura primaria, in 8 giorni; vengono quindi seminati su una lamina perforata dove in alcuni giorni proliferano fino a raggiungere la condizione di pre-confluenza.

L'epitelio autologo viene coltivato in presenza di cellule, fibroblasti murini resi non proliferanti mediante irraggiamento, e di proteine non omologhe (lo stesso siero fetale bovino utilizzato per i fibroblasti). Le colture epiteliali innestate continuano a proliferare e a migrare attraverso le microperforazioni per colonizzare il letto della ferita. Durante la fase pre-innesto si procede alla bonifica dei possibili foci infettivi, che richiede tampone microbiologico con antibiogramma-topobiogramma o antisetticogramma della zona lesa. Se viene riscontrata l'infezione, il paziente dovrà essere trattato con antisettici topici opportuni e con antibiotici locali o sistemici. Tra le medicazioni antisettiche possiamo utilizzare Amuchina al 2-5%, acido Borico al 3%, Nitrato di Ag 0,5-2%, Permanganato di K 0,5% 0 Sulfadiazina di Ag. Tra gli antibiotici locali: Gentamicina, Clindamicina, Meclociclina (l'allergia da contatto è assai remota). L'antibiotico terapia per via sistemica è indicata solo nei casi di infezione clinicamente evidenti. L'ulteriore passo è il debridment chirurgico. Eventuali residui di fibrina o di tessuto necrotico devono essere accuratamente rimossi attraverso curettage chirurgico che cruentando il fondo della ferita creerà, inoltre, le condizioni per un più rapido attecchimento dell’innesto. Se nel debridment è stata utilizzata l'elettrocoagulazione è consigliato aspettare 1-2 giorni. Nella fase dell'innesto, che ha inizio 15 giorni dopo il prelievo biottico, si utilizza una soluzione antisettica per allestire il campo sterile, quindi la soluzione fisiologica per lavarlo via. Si procede applicando il sostituto dermale, prelevato con due pinze sottili a punta arrotondata, direttamente sul fondo della lesione. E’ sempre opportuno evitare di spostarlo perchè la forza di trazione, esercitata su una superfice così delicata, può danneggiare le cellule. Se l'area da ricoprire richiede l’applicazione di più innesti, è necessario che questi siano posti a stretto contatto reciproco. Dopo l'applicazione, l'area deve essere coperta con garza sterile, non aderente, di tipo non medicato, tenuta in situ con un bendaggio lievemente compressivo, ti tipo tradizionale. Per circa dieci giorni non si deve trattare la sede dell'innesto con farmaci topici o altri agenti di cui non sia noto l'effetto citotossico. Durante lo stesso periodo è opportuno limitare al minimo le sollecitazioni meccaniche che possono provocare dislocazioni. Per alcuni distretti corporei, come il calcagno, l'avampiede e aree in prossimità di articolazioni è consigliato l'utilizzo di apparecchi di scarico o l'impiego di particolari precauzioni atte a proteggere il sito d'innesto. In settima giornata si può rimuovere il biomateriale già in via di biodegradazione e in decima giornata, su un fondo granuleggiante, viene applicato il sostituto epidermale.

La medicazione potrà essere rinnovata a partire del quinto giorno dall'innesto, poichè il neo-epitelio è in proliferazione e differenzazione per formare gli strati multipli tipici del normale epitelio. Solo nel caso di accertata infezione in situ, si rimuove subito l'innesto e si procede con la terapia idonea. Il management prevede visite bisettimanali. L'importante in questa tecnica risulta essere l'aproccio multi disciplinare per consentire la riduzione della morbilità ed il trattamento delle patologie di base. Protocollo di valutazione Il protocollo di valutazione deve contemplare lo scor di Wagner e l'assestment vascolare: colore, termotatto, claudicatio intermittens, polsi periferici; doppler artesriosi, ossimetria transcutanea (inferiore a 10 mmHg equivale ad ischemia critica, superiore a 30 mmHg ha invece una prognosi favorevole); indice di Winsor, arteriografia, ecocolordoppler secondo i casi. Indicazioni Le indicazioni riguardano ferite che non danno segni di riepitelizzazione dopo almeno 60 giorni. Rientrano tra queste le ulcere con diverse eziologie: diabetiche (I e II tipo; importante nel "piede diabetico" in quanto è causa frequente di amputazione non traumatica nell'arto inferiore); neuropatiche o neuroischemiche; ulcere con grado di Wagner dal I al II ( III e IV solo dopo bonifica chirurgica); ulcere arteriose, venose, miste, linfatiche, flebostatiche, post-flebitiche, post-trombotiche, post-traumatiche (deiscenze o cheloidi), ustioni, ulcere post-scleroterapia (inestetismi), epatopetiche, emopoietiche (talassemie), connettivopatie, radiodermite, stravaso chemioterapico, panarterite nodosa. Le controindicazioni riguardano soprattutto le piaghe da decubito in allettati, dove l'indicazione è sempre un lembo miocutaneo piuttosto che un innesto; sedi soggette a movimenti, con scarsa compliance del paziente o dove non è possibile l'utilizzo di docce o gambaletti; l'ulcera infetta; margini lesionali sottominati, dove è necessario appianare prima la lesione recintando i margini; la presenza di un fondo secernente; l'esposizione ossea e tanto più l'osteomelite; neoplasie e gravidanza. Le alternative a questa tecnica sono gli innesti cutanei autologhi liberi tradizionali; free flap; skin espanders; guarigione per seconda intenzione; plastica cutanea di scorrimento; chirurgia arterovenosa; OTI (ossigeno terapia iperbarica); ozono terapia. Gli auto-innesti tradizionali sono innesti one-step (utizzando mesh-graft) con prelievi seriati eseguiti in chirurgia d’urgenza e con pratica chirurgica cruenta. Le problematiche degli innesti tradizionali sono molteplici e riguardano sia le aree donatrici che le riceventi. Per le prime vi è senza dubbio un danno jatrogeno, spesso accompagneto da ritardo nella riparazione tissutale o da anomalie della cicatrizzazione. Nei casi di ustione, con interessamento di ampie aree di superficie corporea, la difficoltà principale è la scarsa disponibilità di aree donatrici.

Per quanto riguarda le aree riceventi, le problematiche legate all'innesto autologo sono: l'infezione, il sieroma, l'ematoma, il danno jatrogeno o un letto della ferita non idoneo. I vantaggi dell’ingegneria dei tessuti: è una metodica semplice, che richiede una biopsia in anestesia locale con uno strumentario comune, soprattutto è minimo il trauma ed il disagio del paziente. Inoltre vi è il vantaggio di poter riparare ampi difetti cutanei con la possibilità di più innesti sequenziali, con un'unica biopsia, non precludendo altre metodiche; ha bassi tempi di guarigione e di ospedalizzazione (spesso è possibile effettuarlo in regime di day ospital o DRG) e un rapido recupero sociale.

Prof. Alessandro Scalise

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